冷冻电镜（cryo-EM）已从结构生物学拓展至药物发现、电池设计、材料创新和半导体制造等多个跨学科应用领域。在冷冻电镜成像中，样品需包埋于玻璃态冰层中，而冰层厚度直接影响成像背景噪声、样品分布和最终分辨率。因此，获得厚度合适且均匀的冰层是成功解析结构的前提。然而，近半个世纪以来，冷冻电镜中的冰厚控制始终是关键难题：现有制样技术重复性差，所得冰层厚度不均，且厚度控制主要依赖经验试错。针对这一难题，北京大学彭海琳团队、清华大学王宏伟团队、香港大学刘楠团队等合作，在《Nature Methods》在线发表题为“Control of ice thickness in cryo-EM via confinement”的研究论文。该工作以国产深紫外光刻胶（彤程新材）构筑圆孔阵列，并利用石墨烯下垂形成“石墨烯储液池”；将“石墨烯储液池”用于冷冻电镜样品制备，可精确控制样品的冰层厚度，所得冰层厚度均匀、重复性高，为高分辨率冷冻电镜结构解析提供了一种新的制样策略。
研究团队指出，精确控制冰层厚度的瓶颈在于：亚100纳米液膜本身就不稳定，液体会自发地从较薄区域向较厚区域迁移，导致液膜破裂甚至形成液滴，从而使冰层厚度难以控制，且重复性差。为此，研究团队从限域效应入手，采用工业兼容的深紫外光刻技术制备出孔边缘光滑的均匀孔阵列，并将石墨烯转移至多孔支撑膜上。在范德华力的作用下，石墨烯会自发贴附于孔壁并向下凹陷，形成“石墨烯储液池”。研究团队通过调节孔直径、孔边缘曲率和石墨烯层数等参数，可精确调控石墨烯储液池的深度：当孔直径为600~2000纳米时，石墨烯储液池深度可在10~40纳米之间调节。该工艺还可扩展至4英寸规模，单批次即可制备超过500个自制载网，具备批量制备能力。
得益于上述限域结构，在薄液膜条件下，液体能够自发地从较薄的外围区域向较厚的石墨烯储液池迁移，使体系表现出优异的储液能力。在实践中，即便使用滤纸夹吸载网的时间延长至10秒甚至20秒，液膜仍能保持稳定，最终形成的冰层厚度稳定在约30纳米。该厚度适合高分辨率冷冻电镜成像：既能有效封装生物大分子，同时也不会引入额外的背景噪声。更重要的是，冰层厚度与储液池深度高度匹配：通过调节储液池深度，可实现15nm、20nm、30nm和40nm的冰层厚度可控制备，并在整个载网区域表现出良好的大面积均匀性。这表明，该限域策略不仅能有效抑制薄液膜失稳，也为冰层厚度的精确调控提供了可靠途径。
研究团队进一步将该策略拓展至更具挑战性的石墨烯/冰层/石墨烯三明治体系。传统石墨烯三明治虽在材料科学、化学和生物学等领域备受关注，但其广泛应用长期受限于液池或冰层厚度难以控制的问题。实验结果显示，基于石墨烯储液池的三明治结构可形成厚度约30纳米的均匀限域冰，所得冰层厚度分布较窄，并与储液池的下垂深度高度匹配；并且，该结构的封装成功率超过90%，显著高于传统石墨烯三明治（约67%）。相比之下，传统石墨烯三明治的冰厚约为52 ± 18纳米，且不同区域差异较大。与此同时，在石墨烯储液池所制备的三明治结构中，电子束辐照下样品位移明显降低且差异较小，图像质量也随之提升。此外，当石墨烯层数从单层增至三层时，其二维杨氏模量提高，储液池深度减小，限域冰厚度因此可从约30纳米进一步调节至约19纳米，这一结果与理论模型预测相符。上述结果表明，该策略不仅在传统多孔载网上有效，在石墨烯三明治制样构型中同样具有良好的适用性、稳定性和可调控性。
在冷冻电镜成像中，厚度可控且均匀的冰层为生物大分子提供了良好的衬度和信噪比，使该策略成功应用于多种生物大分子的高分辨率三维重建。其中，LL.LtrB group II intron RNA、SARS-CoV-2 spike蛋白和52 kDa小蛋白streptavidin的三维重建分辨率分别达到2.7 Å、2.9 Å和2.5 Å。这些生物大分子颗粒主要吸附在石墨烯-水界面，远离气液界面，从而缓解了颗粒变性、聚集和优势取向等问题。此外，该方法还可用于喷雾制样技术（spray methods），有效促进微量液滴在载网上自发铺展，为时间分辨冷冻电镜和原位液体电镜等新兴技术提供了新思路。
该研究聚焦冷冻电镜样品制备过程中薄液膜不稳定的热力学限制，将长期依赖经验的冰层厚度控制转变为可设计、可制造的限域结构工程。这一策略不仅解决了冷冻电镜制样中的关键瓶颈问题，也为研究限域液体中的物理、化学和生物过程提供了有力工具。此外，该研究还揭示了纳米图案表面的流体行为，对光刻、刻蚀、清洗等半导体工艺具有重要的指导意义。
该研究工作以“Control of ice thickness in cryo-EM via confinement”为题，于2026年9月25日发表于《自然-方法》（Nature Methods）。北京大学化学与分子工程学院彭海琳教授、清华大学生命科学学院王宏伟教授、香港大学生物科学学院刘楠教授为论文共同通讯作者，北京大学化学与分子工程学院博士后郑黎明、博士毕业生赵效乐、清华大学生命科学学院博士生宋佶岭为论文共同第一作者。该工作得到科技部重点研发计划、国家自然科学基金、北京分子科学国家研究中心、北京生物结构前沿研究中心、清华－北大生命科学联合中心、腾讯新基石科学基金会等资助，并得到了光刻胶龙头企业彤程新材的支持和帮助。